質(zhì)粒提取常見問題

質(zhì)粒提取常見問題
常見問題 1:

可能原因 :大腸桿菌老化 
建議解決方案:請(qǐng)涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)

可能原因 :質(zhì)粒拷貝數(shù)低
建議解決方案:由于使用低拷貝數(shù)載體引起的質(zhì)粒DNA提取量低，可更換具有相同功能的高拷貝數(shù)載體。

可能原因 :溶液使用不當(dāng)
建議解決方案:溶液P2和P3在溫度較低時(shí)可能出現(xiàn)渾濁，應(yīng)置于37℃保溫一段時(shí)間，直溶液變?yōu)榍辶梁蟛拍苁褂谩?/p>

可能原因 :質(zhì)粒未全部溶解(尤其質(zhì)粒較大時(shí))
建議解決方案:洗脫溶解質(zhì)粒時(shí)，可適當(dāng)加溫或延長溶解時(shí)間。

可能原因 :洗脫液加入位置不正確 
建議解決方案:洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位，確保洗脫液能*覆蓋硅膠膜的表面以達(dá)到大洗脫效率。

可能原因 :洗脫液不合適 
建議解決方案:DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如TE和水；洗脫液pH值過低會(huì)降低洗脫效率，應(yīng)確保洗脫液pH值在7.0-8.5之間，當(dāng)用水洗脫時(shí)確保其pH值在此范圍內(nèi)；洗脫時(shí)可將洗脫緩沖液在65-70℃水浴預(yù)熱，加入洗脫液后在室溫靜置2-5分鐘，可提高洗脫效率。

可能原因 :洗脫體積太小
建議解決方案:洗脫液體積若小于30μl，則不易*浸透硅膠膜，使洗脫效率降低；洗脫液體積若超過200μl，則所得的DNA濃度會(huì)降低，但DNA總量不會(huì)減少。為了得到較高的洗脫效率可以適當(dāng)增大洗脫液體積。

可能原因 :洗脫時(shí)間過短 
建議解決方案:洗脫時(shí)間對(duì)回收率也會(huì)有—定影響，洗脫時(shí)放置2分鐘可達(dá)到較好的效果。

可能原因 :堿裂時(shí)間過長 
建議解決方案:加入溶液P2后裂解時(shí)間不應(yīng)超過5分鐘。

常見問題 2:質(zhì)粒純度不高

可能原因 :混有蛋白
建議解決方案:菌體不要過量。經(jīng)溶液P1、P2和P3處理并離心后溶液應(yīng)為澄清的，如果還混有微小蛋白懸浮物，可再次離心去除。

可能原因 :混有RNA
建議解決方案:RNase A處理不*，請(qǐng)減少菌體用量或加入溶液P3后室溫放置一段時(shí)間。若溶液P1已保存6個(gè)月以上，請(qǐng)?jiān)谌芤篜1中添加RNaseA。

可能原因 :混有基因組DNA
建議解決方案:加入溶液P2和P3后應(yīng)溫和混勻，如果劇烈振蕩，可能把基因組DNA剪切成碎片從而混雜在質(zhì)粒中。如果加入溶液P2后過于粘稠，無法溫和混勻，請(qǐng)減少菌體用量。細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞和DNA的降解，培養(yǎng)時(shí)間不要超過16小時(shí)。

可能原因 :含大量核酸酶的宿主菌
建議解決方案:   宿主菌含大量核酸酶，在質(zhì)粒提取過程中降解質(zhì)粒DNA，影響提取質(zhì)粒DNA的完整性，好選用不含核酸酶的大腸桿菌宿主菌，如DH5α和*0。

可能原因 :質(zhì)粒的二聚體和多聚體形式
建議解決方案:是在質(zhì)粒復(fù)制過程中形成的，與宿主菌相關(guān)，電泳可檢測(cè)出多條條帶，單酶切處理后可變成單一條帶。

可能原因 :乙醇?xì)埩?br />建議解決方案: 漂洗液洗滌后應(yīng)離心盡量去除柱中殘留液體，并晾干吸附柱。如果DNA已經(jīng)洗脫出來，可以用酒精沉淀DNA并風(fēng)干，然后再溶解。