基因組DNA提取常見問題

基因組D N A提取常見問題分析

常見問題1：洗脫產物的DNA量很少或沒有
可能原因 ：所提樣品材料老化或反復凍融導致基因組DNA含量下降
建議解決方案：應選擇新鮮的樣品材料，如新鮮血液、新鮮菌液、剛離體的動物組織或幼嫩的植物組織等，不能及時處理的樣品應立即放入液氮或-70℃低溫保存，以免DNA降解。 

可能原因 ：樣品破壁或裂解不*導致基因組DNA未充分釋放
建議解決方案：動、植物材料應在液氮中充分研磨勻漿，G + 細菌、酵母等破壁較困難的樣品應用溶菌酶、酵母破壁酶或機械方式協助破壁，不同樣品的細胞破壁方式可參照前面的詳細介紹。

可能原因 ：樣品量過多導致細胞裂解不充分
建議解決方案： 加樣量過多使裂解液和樣品混合不均勻，細胞裂解不充分。不同來源樣品的加樣量請參照詳細操作步驟。

可能原因 ：DNA吸附不充分
建議解決方案：如在上吸附柱前未加無水乙醇，或用低濃度乙醇代替無水乙醇，則導致DNA不能充分沉淀，與硅膠膜吸附不*，因此應在樣品裂解后加適量無水乙醇，再上吸附柱使DNA與硅膠膜充分吸附。

可能原因 ：DNA洗脫不適當
建議解決方案： 洗脫液pH值過低會降低洗脫效率，應確保洗脫液pH值在7.0-8.5之間；洗脫體積若小于50μl，則不易*浸透硅膠膜，使DNA不能全部洗脫下來，因此洗脫液體積應大于50μl，同時如洗脫液體積過大，超過200μl，則所得的DNA濃度會降低，但DNA總量不會減少；洗脫時可將洗脫緩沖液在65-70℃水浴預熱，加入洗脫液后在室溫靜置2-5分鐘，可提高洗脫效率，提高基因組DNA的產量。

常見問題2：提取的基因組DNA有降解

可能原因 ：選取的材料不新鮮或反復凍融，采集材料后未及時處理或未低溫保存
建議解決方案：陳舊血液、老化菌液等不新鮮的材料中，細胞凋亡導致DNA降解，或低溫保存的樣品反復凍融導致細胞破碎，內源核酸酶降解DNA，因此應選擇新鮮的材料樣品，不能及時處理則低溫保存，運輸過程中亦應使用干冰。

可能原因 ：未能有效抑制內源核酸酶作用
建議解決方案：某些DNase含量較豐富的動、植物組織樣品應在液氮中研磨或勻漿，研磨過程中應隨時補充液氮，并在樣品未*解凍前即加入含有抑制核酸酶作用的鰲合劑的裂解液。

可能原因 ：操作過于劇烈導致DNA被機械打斷
建議解決方案： 預處理的樣品加入細胞裂解液后，所有操作應盡量柔和，避免振蕩、攪拌等劇烈機械力對DNA片段的損傷。

常見問題3：提取的基因組DNA不能順利地進行后續試驗

可能原因 ：樣品量過多導致細胞裂解不充分
建議解決方案：樣品量過多會使裂解液不能快速有效地與樣品充分混合，從而導致樣品裂解不*，殘留大量蛋白、多糖、脂類等雜質，為后續的上吸附柱分離純化造成影響。應加入適當量的樣品材料，具體數量請參照詳細操作步驟。

可能原因 ：DNA在洗脫前有大量乙醇殘留
建議解決方案：有機溶劑乙醇可嚴重抑制內切酶、DNA聚合酶的活性，而在DNA過柱洗滌過程中需使用含有乙醇的漂洗液，因此在洗脫DNA前，—定要充分去除殘留的乙醇，可重復離心，或將吸附柱置于室溫或50℃溫箱中烘干5-10分鐘，再加洗脫液。
  
常見問題4：  提取的基因組DNA中有RNA污染
 
可能原因 ：實驗過程中沒有有效使用RNase A
建議解決方案：應嚴格按照實驗操作要求使用，即加入裂解液的同時加入20μl RNase A溶液，室溫放置10分鐘。

可能原因 ：RNAase A可能失活
建議解決方案：  RNase A須在-20℃下保存，低溫保存時RNase A比較穩定，不易失活，但如果反復凍融會導致RNase A降解失活，所以應妥善保存。